牛地方性白血病琼脂扩散试验操作技术

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(一)材料准备

1．器材及试剂：

打孔器：内径5毫米。

琼脂糖：试剂级。

2．抗原：抗原系冻干产品，用时以蒸馏水溶解，并恢复到原体积。试验时与标准阳性血清之间必须在24小时内出现清晰的沉淀线，与标准阴性血清之间不得出现任何沉淀线。

3．标准阳性血清：能与标准抗原在24小时内产生明显的沉淀线。

4．被检血清：按常规方法采血分离血清。

5．琼脂糖平板的制备：

(1)琼脂糖凝胶的配方：

琼脂糖 1克

NaCl 8．5克

1．0%硫柳汞 1毫升

磷酸缓冲液(0．015M、pH7．2)100毫升

将上述各种成份混合，加热充分溶解，分装瓶中，塞紧后在4℃保存，使用时融化制板。

(2)平板制作：将充分融化的琼脂糖凝胶在50－60℃时加到平皿中，厚度约2毫米，注意不要产生气泡，凝固后把平皿倒置4℃下保存。

(二)操作方法

1．琼脂糖平板打孔：按7孔型打孔，孔径3－5毫米，孔间距3毫米。

2．滴加抗原和血清：中央孔加抗原，1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别加3份被检血清。

各孔一次加满，但不准溢出，平皿加盖后放在湿盒中，于室温(20℃以上)或37℃温箱内作用，经24小时和48小时各检查一次，检查时用斜射强光，背景要暗。

(三)结果判定

1．阳性：根据被检血清中抗体种类和浓度的差别可能出现下列几种结果。

(1)阳性：出现一条清晰沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线完全融合。少数被检血清在此沉淀线的外侧(靠近被检血清孔)，还出现粗而直的第2条沉淀线。

(2)强阳性：有沉淀线但较模糊而宽。遇此情况应将被检血清作1－4倍稀释后重检，应出现清晰沉淀线。

(3)弱阳性：抗原孔和血清孔之间虽无沉淀线，但使两侧标准阳性血清形成的沉淀线末端向被检血清孔内侧弯曲。

2．阴性：被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，标准阳性血清形成的沉淀线直伸到被检血清孔的边缘。

3．可疑：标准阳性血清形成的沉淀线末端在被检血清处稍弯。可用7孔型重检，重检仍为可疑时，判为阳性。

4．非特异性反应：被检血清虽形成沉淀线，但与标准阳性血清沉淀线的末端不相融合，该血清应判为阴性。