猪旋毛虫病快速酶联免疫吸附试验(ELISA)操作技术

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(一)材料准备

1．被检样品。被检血清用0．01MpH7．4PBS0．05%的吐温20作1∶80稀释，全血用宽1．5×3厘米的滤纸片吸附2滴鲜血(耳静脉采血)。注明畜号、编号。试验时将血纸剪下，放小试管中加入1毫升洗涤液，在室温37℃2小时或4℃冰箱过夜。

2．旋毛虫抗原包被反应板。

3．酶结合物——1号液。

4．洗涤液——2号液。

5．底物——3号液。

6．显色剂——4号液。

7．阳性参考血清。人工感染旋毛虫病猪血清，效价不低于1∶100。

8．阴性参考血清。为健康猪分离的血清1∶80稀释O．D值0．03－0．08(450nm)为合格。

以上2、3、4、5、6、7、8项均由河南省农科院畜牧兽医研究所生产。

(二)操作方法

1．加样。在旋毛虫抗原包被反应板的每一孔中，加入被检样品2滴(100微升)，室温(25℃)下静置2－3分钟，然后将其甩干。

2．反应。每孔加1号液1滴(40微升)室温(25℃)静置2－3分钟，并将其甩干。

3．洗涤。每孔加2号液1滴，并随即用自来水或蒸馏水注满各孔洗涤，每次并将孔中的水甩干如此反复洗涤5次以上，最后倒置反应板在吸水纸上，将板孔的残液拍干。

4．显色。在每孔先加3号液1滴，再加4号液1滴，轻轻混匀，室温静置2－3分钟。

(三)结果判定 在白色背景下观察，蓝色者为阳性，无色者为阴性，根据颜色反应的深浅，分弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性()。

(四)注意事项

1．每孔加入2号液后，必须用自来水或蒸馏水充分冲液，否则因洗涤不彻底，易是阴性样品，背景出现有色现象。

2．每次各孔加入1、2、3、4号液的量要均等。否则将影响反应的准确性。

3．第1、3号液要注意保存，污染后不能使用。

4．室温低于25℃，可适当延长每次反应时间。但最终判定结果时，应在5分钟内完成。