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催化在双链DNA单链断裂位置形成磷酸二脂键的酶。基因工程中常用的是T4噬菌体编码的连接酶，反应时需要镁离子和ATP的存在。
在DNA复制过程中，能催化双股DNA中一股缺口的3′ -OH与5′ -磷酸形成磷酸二酯键，使缺口两侧的DNA片段得以连接的酶。
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