脱氧核糖核酸连接酶

DNA连接酶可以从大肠杆菌中提取，且已高度纯化。它是单链构成的，分子量为77,000。它的功能是催化一条DNA链上末端的3′-羟基和另一条DNA链上的5′-磷酸基的连接，形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键时需要能量。不同来源的连接酶需要的能量供应者也不同。由大肠杆菌中提取的连接酶所需的能量由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I,NAD⁺)的焦磷酸键的断裂供应。真核细胞中提取的连接酶所需的能量则由ATP供应。连接酶只能将双螺旋DNA中的一条键上相邻的两个核苷酸间的缺口修补起来。更大的缺口则不发生作用。
大肠杆菌DNA连接酶的作用机制可分为三步。第一步是连接酶和NAD⁺作用，生成酶-一磷酸腺苷复合物(另一产物是NMN+)。第二步是酶上的一磷酸腺苷和缺口上的DNA片段的5′-磷酸基团作用，生成5′-二磷酸腺苷。第三步是另一DNA片段的末端OH将5′-二磷酸腺苷中的一磷酸腺苷置换，生成磷酸二酯键，从而将缺口封闭。
还有一种DNA连接酶是在基因工程技术中常用的，叫T4 DNA连接酶，由感染了某种λ噬菌体的大肠杆菌中提取。它可以连接两个粘性末端或两个平末端，而大肠杆菌DNA连接酶只能连两个平末端的DNA片段。同时该酶的能量来源是ATP。由于这二个特点，该酶广泛应用于重组DNA时各种限制性酶切片段的连接。