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又称基质内菌丝分离法。用已生产食用菌的培养基质来分离繁殖获得纯菌种的方法。根据基质种类的不同，可分为菇（耳）木中菌丝分离、代料培养基中菌丝分离和土壤中菌丝分离3种方法。分离获得的菌种，均应经出菇（出耳）试验方可用于生产。
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